"Intelligent design of color-tuned ChR2 variants for optogenetics applications”

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentado ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraTo better understand the neuronal system, beyond simply “listening” to cells one should be able to “communicate” with them. Until recently, approaches used to establish this communication while relying on the direct manipulation of neurons, have remained technically unsophisticated. Chemical and drug applications provide some degree of cell specificity at the cost of poor spatial and temporal resolution, while direct electrical stimulation of cells, even if allowing for more precise temporal control, lacks in cell type selectivity and may result in tissue damage. In 2005, a new technical approach - Optogenetics - emerged as an answer to these limitations. Based on previously described proteins from the opsin family, such as Channelrhodopsin-2 (ChR2), several groups demonstrated that it was possible to directly manipulate neurons with light. These channels are capable of changing their permeability to certain ionic species upon illumination of specific wavelength and intensity. Using optogenetics, it became possible to activate discrete populations of neurons (-genetic) in a less invasive fashion using light (opto-), under precise temporal control (millisecond time scale) and high spatial resolution (fiber optical light spot). For the past half-decade, great effort has been invested into improving the proprieties of these optogenetic channels and tools. Several enhancements have been achieved in terms of kinetics, for example: Chronos, ChETA and SFO variants; ion permeability: in the eNpHR 3.0 and iC1C2 variants; and in tuning the absorption spectra towards red-shifted variants as in: VChR1 and Crimson. This latter feature has taken up 10 great interest in the optogenetics field due to the scarceness of variants with nonoverlapping absorption spectra. With the recent determination of the crystal structure of ChR it is now possible to apply Time Dependent – Density Functional Theory (TDDFT) to predict the absorption spectra of the Channelrhodopsin using computational algorithms. Therefore, we propose to intelligently manipulate candidate residues to produce color-tuned variants of channelrhodopsin-2, taking advantage of TD-DFT calculations in order to predict the absorption spectra of these variants and, finally, using directed site mutagenesis to generate these mutants and to optimize their expression in a heterologous system. This work describes the successful expression and purification of ChR2 in the Pichia pastoris expression system, and the generation and partial characterization of two novel ChR2 mutants. As a final goal, the determination of ChR2 absorption spectra was set, however, we could not achieve sufficient amount of protein for this analysis, and further optimization is required for the expression and concentration of purified protein samples. Further analysis using electrophysiology is also required to functionally determine the kinetic proprieties of the channel.Para melhor compreender o sistema nervoso, para além de simplesmente “ouvir” as células, é também necessário “comunicar” com estas. Até recentemente, técnicas usadas para estabelecer esta comunicação eram caracterizadas pela sua falta de sofisticação técnica. Aplicação de drogas e outros químicos conferem alguma especificidade no que toca ao tipo de célula activada, no entanto, apresenta uma baixa resolução temporal e espacial. Por outro lado, electrofisiologia, apesar de permitir obter uma enorme resolução espacial e temporal, peca quando consideramos a especificidade celular obtida e a grande probabilidade de causar dano nos tecidos a serem estudados. Em 2005, a técnica “Optogenética” emergiu como uma solução para os problemas técnicos apresentados anteriormente. Esta técnica baseia-se no uso de uma proteína da família das “opsinas”, “Channelrhodopsin-2” (ChR2), que vários grupos mostraram que é capaz de controlar actividade neuronal quando luz incide na mesma. Num mecanismo que envolve a captação de energia luminosa e convertendo-a em mudanças conformacionais da proteína, esta alterna entre estados permeáveis e não permeáveis, sendo possível controlar população geneticamente definidas (-genética) usando luz (opto-), com uma enorme precisão espacio-temporal. Durante a última década, grande investimento foi desenvolvido no que toca a melhorar as propriedades deste canais “optogenéticos”. Grandes melhoramentos foram feitos relativamente a características cinéticas, por exemplo: Chronos, ChETA e variantes SFO; permeabilidade iónica: eNpHR 3.0 e iC1C2; e modificação do espectro 12 de absorbção para maiores comprimentos de onda: VChR1 e Chrimson. Esta última caracteristica têm gerado grande interesse na área já que, até à data, não existem variantes que não apresentem espectros de absorção totalmente distintos. Com a recente determinação da estrutura da ChR é possível aplicar teorias de mecânica quantica como “Time Dependent – Density Function Theory” (TD-DFT) para prever o espectro de absorpção da proteína usando métodos computacionais. Assim, propomos mutar, intelegetemente, resíduos na proteína de forma a obter variantes que respondam a maiores comprimento de onda, tirar partido de TD-DFT para prever os seus espectros e finalmente validados em laboratório, expressando estas variantes num sistema heterologo. Esta tese descrever a expressão e purificação de ChR2 no sistema heterologo de Pichia pastoris. Como objectivo final, a determinação do espectro de absorção da proteína foi delineado, no entanto devido à baixa quantidade de proteína isolada tal não foi possível e assim futuras optimização ao protocolo serão necessárias, assim como várias outras análises, nomeadamente no que toca as propriedades cinéticas da proteína usando técnicas de electrofisiologia